EK310HS-AW1

Rat IL-10 High Sensitivity ELISA Kit

檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）

Catalog Number

EK310HS - 48

EK310HS - 96

定量檢測血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中的大鼠白細(xì)胞介素 10(IL-10)濃度。

本產(chǎn)品僅用于科學(xué)研究，非診斷試劑，不能用于臨床診斷。

一、產(chǎn)品介紹

1. 背景介紹

白細(xì)胞介素 10 (IL-10)是由 2 個長 178 個氨基酸的亞基構(gòu)成的同源二聚體。在人類中，它由位于 1 號染色體的 IL-10 基因編碼，由 5 個外顯子組成。IL10 主要由單核細(xì)胞分泌，淋巴細(xì)胞、II 型輔助性 T 細(xì)胞 (Th2)、肥大細(xì)胞、

CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞和部分活化的 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞分泌較少。它對免疫調(diào)控和炎癥具有多種效應(yīng)。它下調(diào)巨噬細(xì)胞的 Th1 細(xì)胞因子、II 類 MHC 抗原和共刺激分子。它還能增強 B 細(xì)胞存活、增殖和抗體分泌。

IL-10 能阻斷 NF-κB 活性，并參與 JAK-STAT 信號通路調(diào)控。IL-10 的免疫抑制特性提示其可能應(yīng)用于臨床，抑制器-官-移-植后的排斥。IL-10 還具有強烈的消炎特性。

2. 檢測原理

本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。特異性抗大鼠 IL-10 抗體預(yù)包被在高親和力的酶標(biāo)板上。酶標(biāo)板

孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本，經(jīng)過孵育，樣本中存在的 IL-10 與固相抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入生-物-素

化的檢測抗體孵育。洗滌去除未結(jié)合的生-物-素化的抗體，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素 (Streptavidin-HRP)。洗

滌后，加入信號增強劑孵育，洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，再次加入 Streptavidin-HRP。洗滌后，加入顯色底物 TMB，避

光顯色。顏色反應(yīng)的深淺與樣本中 IL-10 的濃度成正比。加入終止液終止反應(yīng)，在 450 nm 波長(參考波長 570 - 630 nm)

測定吸光度值。

3. 試劑盒檢測的局限

1) 請在本試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用。

2) 試劑盒的試劑不能與其他批號的試劑或其他來源的試劑混合使用。

3) 任何標(biāo)準(zhǔn)品稀釋、操作人員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、孵育溫度、試劑盒保存時間的改變，都將影響結(jié)合反應(yīng)。

4) 本試劑盒在設(shè)計上去除或降低了生物學(xué)樣本中的一些內(nèi)源性干擾因素，并非所有可能的影響因素都已經(jīng)去除。

二、基本信息

1. 試劑盒提供的材料

2. 未提供的材料設(shè)備

1) 能夠檢測 450 nm 吸光度的酶標(biāo)儀，參考波長 570 nm 或 630 nm

2) 移液器及槍頭、加樣槽

3) 準(zhǔn)備試劑用的試管、離心管、量筒等

4) 蒸餾水或去離子水

5) 渦旋振蕩器、微孔板振蕩器

3. 貯存

試劑盒保存于 2 - 8℃，有效期標(biāo)注于標(biāo)簽上。只有恰當(dāng)保存的試劑才是有保證的。如果試劑盒的組分需要再次使用，

請確保上一次使用之后沒有被污染。

4. 注意事項

1) 所有的化學(xué)試劑理應(yīng)被認(rèn)為具有潛在危害。

2) 推薦只有經(jīng)過良好實驗室培訓(xùn)的工作人員方可操作本試劑盒。操作時請佩戴合適的防護設(shè)施，例如白大衣、乳膠手

套、安全眼鏡等。

3) 請避免試劑接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸，請立即用大量清水清洗。

4) 試劑盒中的終止液為酸性溶液，在使用終止液時，請佩戴防護服，及防護眼睛、手及面部的設(shè)施。

5) 本試劑盒用于科學(xué)研究，不能用于診斷治療。

6) 請不要使用其他批號或其他來源的試劑替代本試劑盒中的試劑。

7) 請不要使用過期的試劑。

8) 在試劑盒的貯存或孵育過程請避免強光照射。

9) 在操作試劑盒或處理樣本的區(qū)域請不要飲食。

10) 不要讓試劑或樣本接觸皮膚和粘膜。

11) 在操作試劑盒或處理樣本時請佩戴乳膠或一次性手套。

12) 顯色底物避免與氧化試劑和金屬接觸。

13) 避免氣溶膠的產(chǎn)生。

14) 為了避免微生物的污染，以及試劑與樣本間的交叉污染，請使用一次性槍頭。

15) 使用干凈的容器配制試劑。

16) 暴露于酸性環(huán)境會抑制結(jié)合。

17) 試劑的準(zhǔn)備必須使用蒸餾水或去離子水。

18) 顯色底物在使用之前必須平衡至室溫（25℃±3℃）。

19) 樣本可能含有傳染性病原體，處理樣本和可能的污染材料的方法是 121.5℃，最少 1 小時。

20) 液體廢棄物的處理。不含酸的液體廢棄物，加入 1.0 %的次氯酸鈉，浸泡 30 分鐘。含酸的液體廢棄物，請先中和，

再加入次氯酸鈉。

21) 有時標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中可觀察到蛋白沉淀，該沉淀不影響使用，可以忽略。或者可通過 6,000 × g 離心 5 分鐘去除沉淀。

5. 技術(shù)要點

1) 重溶或者混合蛋白的時候，始終避免氣泡產(chǎn)生。

2) 避免交叉污染，在進行標(biāo)準(zhǔn)品加樣、樣本加樣，以及不同試劑加樣的時候，請更換槍頭。不同的試劑，使用不同的

加樣槽。

3) 在應(yīng)用自動洗板機時，加入洗液之后，設(shè)置 30 秒的浸泡程序，或者在不同的洗滌步驟將微孔板掉轉(zhuǎn) 180 度，這樣可

以提高分析的準(zhǔn)確度。

4) 為保證結(jié)果的精確性，孵育時封好封板膜。

5) 顯色底物在添加之前應(yīng)是無色的。保持顯色底物始終處于避光態(tài)。

6) 終止液的添加順序應(yīng)與顯色底物的添加順序相同。

7) 添加終止液之后，底物的顏色應(yīng)由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。如果底物呈現(xiàn)綠色，說明終止液與顯色底物沒有充分混勻。

8) 推薦所有的檢測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品在檢測中設(shè)復(fù)孔。

9) 在任何情況下，避免接觸微孔板的內(nèi)表面。

三、 檢測步驟

1. 樣本采集與貯存

細(xì)胞培養(yǎng)上清

300 × g 離心 10 分鐘去除沉淀物，即刻檢測，或者分裝，-20℃以下貯存。

血清樣本

離心管收集血清。血樣凝集 30 分鐘后，1,000 × g 離心 10 分鐘。吸取血清樣本之后即刻檢測，或者分裝，-20℃以下

貯存。

血漿樣本

EDTA、枸櫞-酸鈉或肝素抗凝收集血漿樣本。1,000 × g 離心 30 分鐘收集樣本。即刻檢測，或者分裝，-20℃以下貯

存。

本試劑盒可能適用于其它生物學(xué)樣本。細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清和血漿已經(jīng)過驗證。

注意：檢測前，樣本中可見的沉淀必須去除。不要使用嚴(yán)重溶血或高血脂的樣本。樣本應(yīng)分裝并貯存于-20℃，以

避免大鼠 IL-10 活性的丟失。如果在 24 小時內(nèi)檢測。樣本可以存放在 2 - 8℃。

避免樣本的反復(fù)凍融。在檢測前，冷凍樣本應(yīng)緩慢地恢復(fù)至室溫（25℃±3℃），輕柔地混勻。

2. 試劑準(zhǔn)備

檢測前請將所有的試劑、樣本恢復(fù)至室溫（25℃±3℃）。

如果濃縮的試劑出現(xiàn)結(jié)晶，37℃溫浴，直至結(jié)晶全部溶解。

1×洗液

吸取 20×濃縮洗液 50 ml 至 1 L 的量筒，加蒸餾水至 1,000 ml，輕輕混勻，避免泡沫。轉(zhuǎn)移至干凈瓶內(nèi)。2 - 8℃貯存，

1×洗液可穩(wěn)定保存 30 天。

1×檢測緩沖液

吸取 10×濃縮檢測緩沖液 5 ml 至 100 ml 量筒，加蒸餾水至 50 ml，輕輕混勻，避免泡沫。2 - 8℃貯存，1×檢測緩沖

液可穩(wěn)定保存 30 天。

檢測抗體工作液

稀釋前充分混勻。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣本的數(shù)量，用 1×檢測緩沖液按 1：100 稀釋濃縮的檢測抗體。

鏈霉親和素工作液

稀釋前充分混勻。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣本的數(shù)量，用 1×檢測緩沖液按 1：100 稀釋濃縮的鏈霉親和素。

信號增強劑工作液

稀釋前充分混勻。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本的數(shù)量，用信號增強劑稀釋液按 1 ：100 稀釋濃縮的信號增強劑。

注意：檢測抗體工作液、鏈霉親和素工作液、信號增強劑工作液均應(yīng)在 30 分鐘內(nèi)使用。

樣本稀釋

為了保證實驗成功，由于對樣本的處理方式，培養(yǎng)條件等不同，建議使用本試劑盒前行一次預(yù)實驗以摸

索的樣本濃度，避免因濃度過高使顯色反應(yīng)超出酶標(biāo)儀的檢測上限或稀釋倍數(shù)過大低于試劑盒靈敏度。 對于樣本

的稀釋，請用 1×檢測緩沖液稀釋血清/血漿樣本，用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞培養(yǎng)上清。

大標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

開蓋前短暫離心，用蒸餾水重溶標(biāo)準(zhǔn)品，重溶體積標(biāo)注于標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)簽上。輕柔地渦旋震蕩，確保充分混勻，重溶

后標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為 800 pg/ml。重溶后靜置 10 - 30 分鐘。稀釋前充分混勻。

請使用聚丙烯管進行標(biāo)準(zhǔn)品稀釋。

血清/血漿樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：

取 230 μl 濃縮的標(biāo)準(zhǔn)品，加入 230 μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度 (400 pg/ml)。在每一個試管中加入

230 μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。使用高濃度標(biāo)準(zhǔn)品做 1：1 系列稀釋。每次移液時，請確保充分混勻。以標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液作為標(biāo)準(zhǔn)曲

線的零濃度。

細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：

取 230 μl 濃縮的標(biāo)準(zhǔn)品，加入 230 μl 細(xì)胞培養(yǎng)基，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度(400 pg/ml)。在每一個試管中加入 230 μl

細(xì)胞培養(yǎng)基。使用高濃度標(biāo)準(zhǔn)品做 1：1 系列稀釋。每次移液時，確保充分混勻。以細(xì)胞培養(yǎng)基作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零濃度。

3. 檢測步驟

檢測之前請將所有的試劑、樣本平衡至室溫（25℃±3℃）。

1) 準(zhǔn)備好所有需要的試劑及工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品。

2) 將不需要的板條拆卸下來，放回裝有干燥劑的鋁箔袋，重新封好封口。

3) 浸泡酶標(biāo)板：加入300 μl 1×洗液靜置浸泡30 秒。為了獲得理想的實驗結(jié)果浸泡是必須的。棄掉洗液之后，在吸水紙上將微

孔板拍干。洗板完成之后，請立即使用微孔板，不要讓微孔板干燥。

4) 加標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品孔加入 100 μl 2 倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。空白孔加入 100 μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(血清/血漿樣本)或培養(yǎng)基(細(xì)

胞培養(yǎng)上清樣本)。

5) 加樣本：血清/血漿：樣本孔加入 90 μl 1×檢測緩沖液和 10 μl 樣本。細(xì)胞培養(yǎng)上清：樣本孔加入 100 μl 細(xì)胞培養(yǎng)上清。

保證步驟 4、5 連續(xù)加樣，不要間斷。加樣過程在 15 分鐘內(nèi)完成。

6) 孵育：使用封板膜封板。100-300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩（保證每孔溶液不撒出且能充分混勻即可），室溫（25℃±3℃）孵育

1.5 小時。

7) 洗滌：棄掉液體，每孔加入 300 μl 洗液洗板，洗滌 6 次。每次洗板，在吸水紙上拍干。為獲得理想的實驗性能，必

須移除殘留液體。

8) 加檢測抗體：每孔加入100 μl“檢測抗體工作液"(參見試劑準(zhǔn)備)。使用封板膜封板。100-300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩（保證每孔溶液不撒

出且能充分混勻即可），室溫（25℃±3℃）孵育30 分鐘。

9) 洗滌：重復(fù)步驟 7。

10) 加酶孵育：每孔加入 100 μl“鏈霉親和素工作液"(參見試劑準(zhǔn)備)

使用新的封板膜封板 100 300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩（保證每

孔溶液不撒出且能充分混勻即可），室溫（25℃±3℃）孵育 30 分鐘。

11) 洗滌：重復(fù)步驟 7。

12) 加信號增強劑孵育：每孔加入 100 μl “信號增強劑工作液"(參見試劑準(zhǔn)備) 。使用新的封板膜封板。100-300 轉(zhuǎn)/

分鐘振蕩（保證每孔溶液不撒出且能充分混勻即可），室溫（25℃±3℃）精確孵育 15 分鐘。

13) 洗滌：重復(fù)步驟 7。

14) 再次加酶孵育：每孔加入 100 μl“鏈霉親和素工作液"(參見試劑準(zhǔn)備) 。使用新的封板膜封板。100-300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩（保

證每孔溶液不撒出且能充分混勻即可），室溫（25℃±3℃）精確孵育 15 分鐘。

15) 洗滌：重復(fù)步驟 7。

16) 加底物顯色：每孔加入 100 μl 顯色底物，避光，室溫（25℃±3℃）孵育 5 - 30 分鐘。

17) 加終止液：每孔加入 100 μl 終止液。顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化明顯不均勻，請輕輕

叩擊板框，充分混勻。

18) 檢測讀數(shù)：在 30 分鐘之內(nèi)，使用酶標(biāo)儀進行雙波長檢測，測定 450 nm 吸收波長和 570 nm 或 630 nm 參考波長

下的 OD 值。校準(zhǔn)后的 OD 值為 450 nm 的測定值減去 570 nm 或 630 nm 的測定值。僅使用 450 nm 測定會導(dǎo)致 OD

值偏高，并且準(zhǔn)確度降低。

如何控制標(biāo)曲顯色？(僅針對雙抗夾心法 ELISA 試劑盒)

5 - 30 分鐘顯色時間為經(jīng)驗范圍，每個具體的實驗，可根據(jù)以下情況，確定大致的顯色時間：

1) 肉眼觀察：標(biāo)曲 S5 孔有淡藍(lán)色、Blank 孔無明顯藍(lán)色時，即可終止；

2) 儀器判斷：630 nm 左右波長下，標(biāo)曲 S1 孔的 OD 值達到 0.5 - 0.7、S5 孔的 OD 值達到 0.05 - 0.08、Blank 孔的 OD

值小于 0.05 時，即可終止；

3) 高敏系列試劑盒因靈敏度更高，需嚴(yán)格控制顯色時長，可較普通試劑盒適當(dāng)縮短顯色時間。

四、分析

1. 結(jié)果計算

計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的平均 OD 值，然后減去零濃度標(biāo)準(zhǔn)品的 OD 值。

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，用計算機軟件進行回歸擬合生成標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w分析確定擬合曲線。

通過對濃度值和 OD 值取對數(shù)擬合，可以對標(biāo)準(zhǔn)曲線進行線性化。此過程可能可以得到更多樣本的濃度，但數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確

度會降低一些。

注意：標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度點的終濃度為 400 pg/ml。

如果血清/血漿樣本按照說明書進行稀釋，最終的稀釋倍數(shù)為 10。如果樣本進行了其它方式的稀釋，計算樣本濃度

時請乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

2. 典型數(shù)據(jù)

每次檢測，每塊酶標(biāo)板都必須設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)曲線。下面的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅作為示例參考。

3. 靈敏度

大鼠 IL-10 的可檢測濃度為 0.22 pg/ml (6 次獨立實驗的平均值)。

10 個零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩倍 SD，計算可檢測濃度。

4. 精密度

酶標(biāo)板內(nèi)精密度

3 個已知濃度的樣本酶標(biāo)板內(nèi)重復(fù)測定 20 次，評估酶標(biāo)板內(nèi)的精密度。

酶標(biāo)板間精密度

3 個已知濃度的樣本酶標(biāo)板間重復(fù)檢測 6 次，評估酶標(biāo)板間的精密度。

5. 回收率

5 份健康大鼠血清中加入 3 個不同濃度水平的大鼠 IL-10，未加大鼠 IL-10 的血清作為本底，計算回收率。回收率的范圍從 94 %至 115 %，平均回收率為 103 %。

6. 稀釋線性

5 份健康大鼠血清中加入高濃度的大鼠 IL-10，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線的動力學(xué)范圍內(nèi)進行系列稀釋，評估檢測的線性。

本試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品為聯(lián)科生物校準(zhǔn)的高純度重組大鼠 IL-10。

8. 樣本值

應(yīng)用本試劑盒，檢測 30 份健康 SD 大鼠的血清樣本。

n.d. = 測不到濃度值。樣本的濃度值低于靈敏度被認(rèn)為測不到濃度值。

注意: 此樣本值范圍非生理值范圍。健康大鼠樣本的濃度范圍因種屬、樣本制備以及檢測人員、設(shè)備的不同而有所

不同。以上數(shù)據(jù)僅供參考。

9. 特異性

本試劑盒識別天然和重組大鼠 IL-10。下述因子進行了特異性的評估，沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)和干擾影響。

 檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）