ATP 含量測試盒（化學(xué)發(fā)光法）

（貨號：A095-2 200T 化學(xué)發(fā)光法）

一、測定意義：

三磷酸腺苷（Adenosine 5'-triphosphate，ATP）是生物

體內(nèi)能量轉(zhuǎn)換最基本的載體, 其含量的變化直接關(guān)系到各

器官的能量代謝。ATP 作為最重要的能量分子在細(xì)胞的各

種生理、病理過程中起著重要作用。ATP 水平的改變，會

影響許多細(xì)胞的功能。通常細(xì)胞在凋亡、壞死或處于一些

毒性狀態(tài)下，ATP 水平會下降，而高葡萄糖刺激等對于一

些細(xì)胞可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi) ATP 水平。通常 ATP 水平的下降

表明線粒體的功能受損或下降，在細(xì)胞凋亡時(shí) ATP 水平的

下降通常和線粒體的膜電位下降同時(shí)發(fā)生。

二、測試原理：

本試劑盒根據(jù)螢火蟲熒光素酶(Firefly Luciferase)催

化熒光素產(chǎn)生熒光時(shí)需要 ATP 提供能量研制而成。當(dāng)螢火

蟲熒光素酶和熒光素都過量時(shí)，在一定的濃度范圍內(nèi)熒光

的產(chǎn)生和 ATP 的濃度成正比。這樣就可以高靈敏地檢測溶

液中的 ATP 濃度。

本試劑盒在樣品體積為 100μL 時(shí)可以檢測濃度低達(dá)

1nmol/L 的 ATP。而常規(guī)的細(xì)胞或組織裂解液中 ATP 的濃

度僅為 0.1- 1μmol/L，一些常見細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi) ATP 水平約

為 10nmol/mg 蛋白。

四、保存條件：

-20℃保存 6 個(gè)月。-80℃可保存一年。底物酶貯備液

需避光保存。

五、樣本前處理：

1、貼壁細(xì)胞：

吸除培養(yǎng)液，按照 6 孔板每孔加入 200μL 裂解液裂解

細(xì)胞。裂解細(xì)胞時(shí)為了裂解充分，可以使用移液器進(jìn)行反

復(fù)吹打，或晃動(dòng)培養(yǎng)板使裂解液充分接觸并裂解細(xì)胞。通

常細(xì)胞在接觸裂解液后會立即裂解。裂解后 4℃,12000g

離心 5 分鐘，取上清，用于后續(xù)的測定。

2、懸浮細(xì)胞：

用離心管離心沉淀細(xì)胞，棄上清，輕輕彈散細(xì)胞，按

照 6 孔板每孔加入 200μL 裂解液裂解細(xì)胞。裂解細(xì)胞時(shí)為

了裂解充分，可以彈擊離心管管底，適當(dāng) Vortex 使裂解液

充分接觸并裂解細(xì)胞。通常細(xì)胞在接觸裂解液后會立即裂

解。裂解后 4℃，12000g 離心 5 分鐘，取上清，用于后續(xù)

的測定。

3、組織樣本：

按照每 20 毫克組織加入約 100-200μL 裂解液的比例加

入裂解液，然后用玻璃勻漿器或其它勻漿設(shè)備進(jìn)行勻漿。

充分勻漿可確保組織被裂解。裂解后 4℃，12000g 離

心 5 分鐘，取上清，用于后續(xù)的測定。

六、操作步驟

1、加 100μL 酶工作液到檢測孔或檢測管內(nèi)。室溫放置 3-5

分鐘，以使本底性的 ATP 全部被消耗掉，從而降低本

底?？梢砸淮涡园?/span> 10-20 個(gè)檢測孔或檢測管分別加上

100μL 酶工作液，從而節(jié)省時(shí)間。

2、在檢測孔或檢測管內(nèi)加上 20 微升樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，迅速

用 槍 ( 微 量 移 液 器 ) 混 勻 ， 至 少 間 隔 2 秒 后 ， 用

Luminometer 或液閃儀測定 RLU 值或 CPM。

3、為了消除樣品制備時(shí)由于蛋白量的差異而造成的誤差，

可以用南京建成生產(chǎn)的蛋白濃度測定試劑盒測定樣品

中的蛋白濃度。然后把 ATP 的濃度換算成 nmol/mg 蛋

白的形式。

七、注意事項(xiàng)：

1、酶貯備液中含有熒光素酶，反復(fù)凍融會導(dǎo)致其逐漸失

活。建議使用時(shí)的凍融次數(shù)不宜超過 3 次。酶貯備液

稀釋成酶工作液后，一次用完，不宜凍存后再使

用。

2、ATP，特別是裂解后樣品中的 ATP 在室溫不太穩(wěn)定，

需在 4℃或冰上操作。ATP 在冰上可以穩(wěn)定達(dá) 6 小時(shí)。

3、本試劑盒需使用化學(xué)發(fā)光儀(Luminometer)。如果沒有

化學(xué)發(fā)光儀，也可以使用液閃儀。液閃儀的測定效果

取決于其檢測靈敏度和檢測精度。

4、測定之前建議先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，樣品的體積可以自行在

10-100μL 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。如果樣品中的 ATP 濃度比較低，

則可以加入 100μL 樣品，如果樣品中 ATP 濃度比較高，

則可以加入小體積的樣品，同時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品也需要使用相

同的體積。如果樣品中 ATP 的濃度特別高，可以用裂

解液稀釋樣品后再測定。

5、使用可檢測化學(xué)發(fā)光的多功能酶標(biāo)儀時(shí)，所用 96 孔板

宜為孔和孔之間不透光的黑板或白板。如使用常規(guī)的

透明 96 孔板，需特別注意正確設(shè)置酶標(biāo)儀測定時(shí)板子

的類型，同時(shí)也可以在檢測孔之間設(shè)置間隔孔，以盡

量避免鄰近孔之間的相互干擾。

6、本試劑盒提供的裂解液可以有效裂解并釋放常見的培

養(yǎng)細(xì)胞和組織中的 ATP。對于一些特殊的組織或樣品，

如果發(fā)現(xiàn)檢測出來的 ATP 水平顯著低于預(yù)期水平，可

以在裂解樣品后并且在離心前，取部分樣品煮沸 2 分

鐘以充分釋放 ATP。煮沸后樣品中的蛋白會變性，從

而會在后續(xù)的離心步驟中被沉淀，因此煮沸的樣品不

能用于蛋白濃度測定、SDS-PAGE 和 Western 檢測?？?/span>

以使用剩余的部分樣品進(jìn)行蛋白濃度測定、SDS-PAGE

和 Western 檢測。

7、本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床

診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通

住宅內(nèi)。

8、為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操

作。

八、產(chǎn)品特點(diǎn)：

1、適用范圍廣，本試劑盒可用于檢測組織、細(xì)胞中 ATP

含量。

2、靈敏度高，本試劑盒可檢測 1nmol/L 的 ATP。

3、樣本制備簡單，本試劑盒提供了可以用于細(xì)胞和組織

裂解的裂解液，簡單裂解后即可用于 ATP 檢測。無需

進(jìn)行高氯酸或三氯-乙-酸(TCA)抽提，煮沸等繁瑣操作。

4、穩(wěn)定性高，本試劑盒進(jìn)行了特殊的優(yōu)化設(shè)計(jì)，使檢測

ATP 時(shí)的化學(xué)發(fā)光非常穩(wěn)定。對于 ATP 標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢

測結(jié)果顯示，在開始反應(yīng)后 10 分鐘內(nèi)化學(xué)發(fā)光無明顯

下降，開始反應(yīng)后 30 分鐘內(nèi)化學(xué)發(fā)光的下降不超過

10%。

5、測定多樣性，使用本試劑盒中的裂解液裂解獲得的細(xì)

胞或組織樣品，不僅可以用于 ATP 檢測，還可用于檢

測蛋白濃度、進(jìn)行 SDS-PAGE 或一些常規(guī)的較易溶解

蛋白的 Western 檢測。

6、方便快捷，本試劑盒的使用方便快捷，通常 10-20 個(gè)

樣品可以在 30-60 分鐘內(nèi)測定完畢。

附錄 I：標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

1、標(biāo)準(zhǔn)品制備：

冰浴上溶解待用試劑，把 0.5mmol/L 的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液

用裂解液稀釋成 0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2μmol/L

的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液，待測。

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：

a、加 100μL 酶工作液到檢測孔內(nèi)。室溫放置 5 分鐘，以

使本底性的 ATP 全部被消耗掉，從而降低本底。

b、在檢測孔內(nèi)加上 20μL 標(biāo)準(zhǔn)品，迅速用微量移液器混勻，

間隔 2 秒后，用 Luminometer 測定 RLU 值。

ATP 含量測試盒（化學(xué)發(fā)光法）