易洗脫鏈霉親和素-瓊脂糖

1 、產(chǎn)品介紹

ee-SANUPharoseFF是將基因工程改造的鏈霉親和素（Streptavidin ，SA）和瓊脂糖凝膠偶聯(lián)而成的親和層析分離介質(zhì)。ee意為易洗脫（easy elution），即可以溫和洗脫結(jié)合在介質(zhì)上的生物素化物質(zhì)，如生物素化抗原、生物素化抗體、生物素化蛋白、生物素化核酸等，可用于Avi-Tag融合表達的生物素化蛋白的純化、經(jīng)過標(biāo)記反應(yīng)后的生物素化和非生物素化物質(zhì)的分離、生物素化抗原抗體固定化和重復(fù)回收利用等。

Streptavidin NUPharoseFF，由于鏈霉親和素與生物素的超-強親和力，溫和常用的方法不能將生物素標(biāo)記物質(zhì)洗脫。ee-SA配基經(jīng)過分子層面的設(shè)計改造，大幅降低了與生物素的親和力，同時保持了與生物素的特異性。結(jié)合在ee-SANUPharose FF填料上的生物素化物質(zhì)可通過含D-生物素的緩沖液競爭洗脫，該洗脫方式溫和，一般不會影響目標(biāo)物的活性，洗脫液中的D-生物素可通過換液方式去除。因而通過ee-SANUPharoseFF的一步層析就可獲得有活性、高純度的生物素化物質(zhì)。

2 、產(chǎn)品特點與技術(shù)指標(biāo)

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍；bDBC10%測試條件為：D-生物素標(biāo)記 BSA ，10%流穿，6 min 停留時間；c 10 cm 柱高下的測試流速。

3 、易洗脫鏈霉親和素填料應(yīng)用原理簡介

鏈霉親和素與D-生物素之間的親和力非常高，其解離常數(shù)在10?14 mol/L 數(shù)量級，是自然界最-強的非共價相互作用之一。因而常規(guī)的Streptavidin NUPharose FF填料與生物素標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合后，需要在變性條件下洗脫。在該使用方式下，樣品易失活，填料的性能也受影響。

ee-SANUPharoseFF填料上的ee-SA配基經(jīng)過基因工程改造后，保持了與生物素的 特異性的同時，削弱了親和力，因而可通過 D-生物素競爭洗脫（圖 1），擴展了鏈霉親 和素填料的應(yīng)用范圍。圖 2 為 ee-SANUPharoseFF 純化生物素化物質(zhì)的過程，包含特異 性結(jié)合、D-生物素競爭洗脫、NaOH 再生等環(huán)節(jié)。

4 、使用方法參考

 4.1 色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體做脫氣處理。

填料用量計算：通過沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定 體積。ee-SANUPharoseFF的壓縮比為1.15。為使達到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積，抽濾除去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復(fù)3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入適量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時使用裝柱器），為避免引入氣泡，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下。將所有填料加入后，用裝柱液將裝柱器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定，標(biāo)記界面穩(wěn)定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關(guān)閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對應(yīng)的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料。

4.2  柱效測定和評價

完成裝柱后、使用前可通過柱效測定和評價可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量。柱效通常用 理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價。

4.3  平衡與上樣

（1）緩沖液選擇：一般選用pH6~8的結(jié)合緩沖液，常用緩沖液有10~100mM磷 酸鈉緩沖液、20~200mM Tris-HCl緩沖液等，根據(jù)樣品的穩(wěn)定性，也可添加其他成分，如NaCl、還原劑、螯合劑等。若不確定最合適的緩沖體系，在初次使用ee-SANUPharose FF時，推薦使用20mM PBS（20 mM NaH2PO4，0.15 M NaCl，調(diào)節(jié)pH 7.4）或20 mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0作為結(jié)合緩沖液。

（2）樣品處理：樣品的緩沖液應(yīng)與所選結(jié)合緩沖液一致。為保證緩沖液一致，可以在結(jié)合緩沖液中破碎細菌、或調(diào)解pH 與結(jié)合緩沖液一致、或交換至結(jié)合緩沖液（常用方法有透析、超濾、脫鹽柱換液等）、或用結(jié)合緩沖液稀釋2~10倍等。樣品上柱前應(yīng)0.45μm過濾。

（3）平衡：用結(jié)合緩沖液平衡5個柱體積，建議流速為~150 cm/h

（4）上樣流速：推薦線性流速20~100 cm/h。較小的流速有利于載量的提高，可根據(jù)實際結(jié)合情況選擇流速，能獲得較好的效果。

（5）再平衡：上樣后用結(jié)合緩沖液再平衡5~10個柱體積，或平衡至基線，洗去雜質(zhì)，推薦流速為~150 cm/h。

4.3 洗脫

結(jié)合了生物素化物質(zhì)的ee-SANUPharoseFF可采用溫和的方式洗脫，一般在結(jié)合緩沖液中加入1-10 mM的D-生物素作為洗脫緩沖液，通過競爭的方法洗脫。

4.4 再生

（1）填料使用后需要再生，本產(chǎn)品耐受一定的堿性，推薦使用2~5個柱體積的 20-100 mM NaOH 溶液反向清洗柱子，進行再生，推薦流速為~150 cm/h。

（2）其他方法，比如 1-2M NaCl 、70%乙醇、30%異丙醇等，也可用于該介質(zhì)的再生。

4.5 填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇，使用過后可繼續(xù)用20%乙醇保存。保存溫度在2~8℃為宜，不可凍存。