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果糖磷酸激酶活性測定試劑盒 生化試劑

果糖磷酸激酶活性測定試劑盒,廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,負責將果糖-6-磷酸和ATP轉換為果糖-1,6-二磷酸和ADP,是糖酵解過程的關鍵調節(jié)酶之一。

產品型號:

更新時間:2025-01-28

果糖磷酸激酶活性測定試劑盒

6-phosphofructokinase,分光光度法 50T/48 樣)

一、測定意義

果糖磷酸激酶(PFK)廣泛存在于動物、植物、微生物

和培養(yǎng)細胞中,負責將果糖-6-磷酸和ATP轉換為果糖-1,6-

二磷酸和ADP,是糖酵解過程的關鍵調節(jié)酶之一。

二、測定原理

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和

ADP,丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化NADH氧化

生成NAD+,在340 nm下測定NADH下降速率,即可反應PFK

活性。

三、自備儀器用品

離心機、紫外分光光度、水浴鍋、1mL石英比色皿、移

液槍、研缽、冰和蒸餾水

四、試劑組成和配制

提取液:60mL×1 , 4℃保存

試劑一:40mL×1 瓶,4℃保存

試劑二:粉劑×1 瓶,-20℃保存,臨用前加2.8mL蒸餾水充

分溶解,用不完的試劑-20℃分裝保存不能反復凍融

試劑三:粉劑×1 支,4℃保存,臨用前加0.26mL蒸餾水充

分溶解,用不完的試劑-20℃分裝保存不能反復凍融

試劑四:液體×1 支,4℃保存,臨用前加0.26mL蒸餾水充

分溶解,用不完的試劑-20℃分裝保存不能反復凍融

五、樣品前處理

1、細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心

后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(10 4個):提取液體積

mL500-10001的比例(建議1000萬細菌或細胞加

1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率

20%或200W,超聲3s,間隔10 秒,重復30 次);在4°C

8000g離心10min,取上清,置冰上待測。

2、組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~10

比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進行冰

浴勻漿。8000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測。

3、血清(漿)樣品:直接檢測

六、測定步驟

1. 分光光度計預熱30min 以上,調節(jié)波長到340nm,用蒸餾

水調零。

2. 工作液(可測25個樣)的配置:取19mL試劑一和1.26mL

試劑2充分混勻;用不完的試劑4℃保存一周。

3. 將工作也置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預熱

10min。

注意:不同勻漿組織中PFK活性不一樣,做正式試驗

之前請做1-2只預實驗,若A>0.5,則說明活力太高,

必須用提取液稀釋成適當濃度勻漿上清液(計算公式

中乘以相應稀釋倍數(shù)),或縮短反應時間至2min

5min,使得A<0.5,以提高檢測靈敏度。

七、PFK活性計算

1、血清(漿)活力的計算:

單位的定義:每mL 血清(漿)在每分鐘催化1nmol果糖

-6-磷酸和1nmolATP轉換為1nmol果糖-1,6-

磷酸和1nmolADP定義為一個酶活力單位。

PFK(U/mL) = [A×V反總÷(ε×d)×10 9]÷V ÷T

=450×A

2、組織、細菌或細胞中PFK活力計算

1.按組織蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol果糖-6-

磷酸和1nmolATP轉換為1nmol果糖-1,6-

二磷酸和1nmolADP定義為一個酶活力

單位。

PFK(U/mg) = [A×V反總÷(ε×d)×10 9]÷(Cpr×V)÷T

=450×A÷Cpr

2.按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和

1nmolATP轉換為1nmol果糖-1,6-二磷酸

1nmolADP定義為一個酶活力單位。

PFK(U/mg) = [A×V反總÷(ε×d)×10 9]÷(W×V ÷V樣總)÷T

=450×A÷W

3. 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化1nmol

-6-磷酸和1nmolATP轉換為1nmol果糖

-1,6-二磷酸和1nmolADP定義為一個酶

活力單位。

PFK(U/mg) = [A×V反總÷(ε×d)×10 9]÷(1000×V÷V樣總)÷T

=0.45×A

εNADH340nm 處摩爾吸光系數(shù)為6.22×10 3L/mol/cm;

d :比色皿光徑(cm),1cm;

V反總:反應體系總體(L),840μL=8.4×10 -4L

10 91mol=1×10 9nmol;

Cpr:上清液蛋白質濃度(mg/mL

V:加入反應體系中上清液體積(mL),30μL=0.03mL;

V樣總:加入提取液體積,1mL

T:催化反應時間(min),10min。

W,樣本質量,(g

1000 細菌或細胞總數(shù),1000萬。

果糖磷酸激酶活性測定試劑盒 

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