elisa試劑盒的操作要點
點擊次數(shù)：421 更新時間：2024-04-17
elisa試劑盒的操作要點
elisa試劑盒
操作步驟包括樣本的采集和保存、試劑和樣本的平衡、加樣、溫育、洗滌、顯色、比色、結(jié)果判定和結(jié)果報告。環(huán)節(jié)眾多，任一環(huán)節(jié)操作不當，皆可影響測定結(jié)果。因此，必須重視各環(huán)節(jié)操作，掌握控制要點，方能保證檢測結(jié)果準確可靠
樣本的采集和保存
作為激素和治療藥物測定的樣本應(yīng)考慮采集時間及體位等因素影響,可-的松和促甲狀腺激素清晨會有一峰值出現(xiàn)；生長激素、促黃體激素、促卵泡激素均以陣發(fā)性方式排放；從臥位變?yōu)檎疚粫r，腎素活性將明顯增高；藥物濃度監(jiān)測應(yīng)根據(jù)藥代動力學選擇合適時間采集樣本。
內(nèi)源性干擾因素對檢測結(jié)果的影響，如類風濕因子、補體、異嗜性抗體、自身抗體、鼠抗體診療所致抗鼠Ig抗體、溶-菌酶等?？梢酝ㄟ^稀釋、加熱、改變固相和酶標抗體、使用雞抗體IgY以及理化方法去除干擾因子。
外源性干擾因素對檢測結(jié)果的影響，溶血、脂血、細菌污染、血液標本收縮不充分、存貯過久、反復融凍等。盡量使用玻璃試管抽血，慎用塑料試管盛血，因聚乙烯易吸附抗原和抗體，影響檢測結(jié)果。
2日內(nèi)測定血液樣本，，置2℃—8℃冰箱保存；2日至7日內(nèi)測定，置2℃—8℃冰箱保存；7日以上測定，置-20℃以下冰箱保存。
試劑和樣本的平衡
試劑和樣本在測定前應(yīng)先放置室溫（20℃—25℃）平衡20分鐘以上，以保證后續(xù)操作步驟中抗原抗體足夠反應(yīng)溫度。
加樣本及試劑
應(yīng)正確使用移液器和試劑滴瓶。移液器應(yīng)定期校準和維護，加樣本時，應(yīng)加在微孔下1/3處，不可擦劃底部、沖起泡、加到微孔上緣或濺出。滴加試劑（包括抗原、酶結(jié)合物及顯色劑）時，應(yīng)搖勻試劑，先棄去瓶口1—2滴，然后垂直、均勻加入微孔。
溫育
溫育是ELISA操作中的關(guān)鍵步驟。國產(chǎn)試劑通常采用37℃30分鐘和37℃60分鐘兩種方式。為保證溫度均一，抗原抗體反應(yīng)充分，宜采用水浴方式加熱。如用孵箱，可內(nèi)置一方盤，底襯紗布，加入適量水，微孔板放入其中溫育。
洗滌
ELISA為異相固態(tài)方式檢測，所以分離結(jié)合和游離酶結(jié)合物是一個重要環(huán)節(jié)，洗滌即是達到這樣一個目的。洗板質(zhì)量直接影響檢測結(jié)果，所以需重視洗板質(zhì)量?，F(xiàn)在新推出的洗板機大多增設(shè)有兩點吸液、底部沖洗和振蕩等功能，可以充分保證洗板質(zhì)量。手工洗板時，應(yīng)嚴格按照試劑說明書操作，洗滌不足和洗滌過度都將影響檢測結(jié)果。
顯色
ELISA顯色常用TMB和H2O2作為顯色劑，顯色時間37℃15—20分鐘，顯色過程可不避光。使用前應(yīng)檢查顯色劑是否變質(zhì)，嚴格控制顯色時間。顯色劑質(zhì)量檢查，在玻片、試管或eppendorf管中滴入顯色劑A和B各一滴，若不變色，則質(zhì)量可靠。繼續(xù)滴入一滴酶結(jié)合物，搖勻后幾分鐘內(nèi)溶液出現(xiàn)藍色，既可檢查顯色劑質(zhì)量，又可檢查酶結(jié)合物質(zhì)量。
比色
加終止液終止顯色反應(yīng)后，通常要求30分鐘內(nèi)用酶標儀完成比色測定。采用主波長450nm測定，可有效避免微孔上的劃痕、指印及其它附著物對光的干擾。另外，加終止液后，應(yīng)盡快比色，因為呈色深的微孔易出現(xiàn)沉淀致吸光度下降明顯。
結(jié)果判斷和結(jié)果報告
判斷結(jié)果時，要正確按照試劑盒要求設(shè)置計算參數(shù)，內(nèi)外對照值均應(yīng)在控，才能判定測定結(jié)果有效。對于少見模式和臨界值附近結(jié)果應(yīng)堅持復核
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