細(xì)胞中的 RNA 可以分為信使 RNA、轉(zhuǎn)運(yùn) RNA 和核糖體 RNA 三大類，不同組織總 RNA 提取的實(shí)質(zhì)就是將細(xì)胞裂解，釋放出 RNA，并通過不同方式去除蛋白，DNA 等雜質(zhì)，終獲得高純度 RNA 產(chǎn)物的過程。

RNA 提取流程

1.樣品處理

從各種不同來(lái)源樣品（如細(xì)菌、酵母、血液、動(dòng)物組織、植物組織和培養(yǎng)細(xì)胞）,或同一來(lái)源樣品的不同組織（如植物幼嫩葉片、成熟根、莖等）中提取高質(zhì)量的 RNA，因細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，樣品預(yù)處理的方式也各有差異。

樣品的要求

使用新鮮的樣品或取樣后立即在低溫（-20℃或-70℃）冷凍保存的樣品，避免反復(fù)凍融，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致提取的 RNA 降解和提取量下降。

樣品預(yù)處理方式

植物材料-液氮研磨

動(dòng)物材料-勻漿、液氮研磨

細(xì)菌-溶菌酶破壁

酵母-液氮研磨、玻璃珠處理、混合酶破壁

2.細(xì)胞裂解

異硫氰酸胍/苯酚法（TRIZOL）

這是一種傳統(tǒng)的 RNA 提取方法，適用于大部分動(dòng)植物材料，但對(duì)于次生代謝產(chǎn)物較多的植物材料提取 RNA 效果較差。異硫氰酸胍能使核蛋白復(fù)合體解離，并將 RNA 釋放到溶液中，采用酸性酚-氯f(wàn)ang混合液抽提，低 PH 值的酚將使 RNA 進(jìn)入水相，而蛋白質(zhì)和 DNA 仍留在有機(jī)相，從而可以完成 RNA 的提取工作。

該法應(yīng)用非常廣泛，適用于包括動(dòng)物組織、微生物、培養(yǎng)細(xì)胞等在內(nèi)的各類動(dòng)物性材料，同時(shí)還適用于次生代謝物較少的植物性材料，如幼苗、幼葉等。該法主要應(yīng)用在動(dòng)物組織和培養(yǎng)細(xì)胞的 RNA 提取中。

胍鹽/β-巰基乙醇法

適用于各種不同動(dòng)物材料和次生代謝物少的植物材料。

在這種方法中，胍鹽使細(xì)胞充分裂解，β-巰基乙醇作為蛋白的變性劑在實(shí)驗(yàn)全程中可以抑制 RNaseA 的活性，保護(hù) RNA 不被降解。有些植物材料多糖多酚含量較高，如植物果實(shí)，番茄的葉子等，有些植物木質(zhì)化程度較高，如根莖等組織。針對(duì)這類材料本公司推出了一種全新的植物總 RNA 提取試劑，該試劑特別適合于從富含多糖、多酚、淀粉的材料中提取純度高、完整性好的總 RNA，有關(guān)的具體步驟將在分論中詳細(xì)介紹，實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)自己的需要進(jìn)行選擇。

3.RNA 純化及獲得

純化要求

RNA 樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶（如逆轉(zhuǎn)錄酶）有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染。排除 DNA 分子的污染。

純化方法及沉淀

方法一：有機(jī)溶劑抽提法

氯f(wàn)ang抽提

在使用 RNA 提取試劑進(jìn)行 RNA 提取時(shí)，常使用氯f(wàn)ang進(jìn)行抽提，以去除蔗糖、蛋白等雜質(zhì)，并促進(jìn)水相與有機(jī)相的分離，從而達(dá)到純化RNA 的方法。

沉淀

氯f(wàn)ang抽提 RNA 后，一般采用了異丙醇或乙醇來(lái)沉淀水相 RNA。加入 0.6 倍水相體積的異丙醇或與水相等體積的異丙醇，室溫沉淀 20-30 分鐘，高速離心，可獲得 RNA 沉淀。

洗滌沉淀

加入無(wú) RNase 的 75%乙醇，將 RNA 沉淀振蕩懸浮，使 RNA 沉淀中的鹽離子被充分溶解。然后再離心 10-30 分鐘。再次沉淀 RNA。離心后，小心倒掉上清（注意不要倒出 RNA 沉淀），隨后快速離心 1-2 秒，將殘留在管壁上的乙醇試劑到管底后，用小槍頭吸凈，超靜臺(tái)中風(fēng)干 1-2 分鐘（注意不要晾得太干，否則 RNA 沉淀不易溶解）。

溶解沉淀

加入適量 RNase-free ddH2O 溶解 RNA 沉淀。

方法二：硅基質(zhì)吸附法

隨著實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)，現(xiàn)已發(fā)展出一種采用吸附材料純化核酸的方法。目前較常見的有：硅基質(zhì)吸附材料、陰離子交換樹脂和磁珠等。硅基質(zhì)吸附材料具有可特異吸附核酸，使用方便、快捷、不使用有毒溶劑如苯酚、氯f(wàn)ang等優(yōu)點(diǎn)。

一些特殊組織的 RNA 提取

纖維組織

心臟/骨骼肌等纖維組織提取 RNA 的關(guān)鍵在于*破碎組織。這些組織細(xì)胞密度低，單位重量的組織中 RNA 含量較低，建議增加起始量。

此外，一定要在液氮中將組織*磨碎。

蛋白/脂肪含量較高的組織

腦或植物脂肪含量高，酚/氯f(wàn)ang抽提后，上清含白色絮狀物。必須用氯f(wàn)ang再次對(duì)上清進(jìn)行抽提。

核酸/RNase 含量高的組織

脾、胸腺等組織的核酸和 RNase 含量很高，在液氮中研磨，再快速勻漿，能有效滅活 RNase。如加入裂解液后變得粘稠，酚/氯f(wàn)ang抽提不能有效分層，則加入更多裂解液可以解決此問題。多次酚/氯f(wàn)ang抽提可以去除更多殘留的 DNA。如果加入乙醇后馬上有白色沉淀形成，表明可能有 DNA 污染，可以在核酸溶解后用酸性酚/氯f(wàn)ang再次抽提或者用 Dnase1 消化，去除 DNA 污染。

植物組織和真菌組織

植物組織和真菌組織比動(dòng)物組織更為復(fù)雜，一般選擇在液氮條件下對(duì)樣品進(jìn)行研磨，以避免內(nèi)源 RNase 降解 RNA。如果 RNA 降解問題不能解決，大多數(shù)情況下是樣品中含有的雜質(zhì)所致。許多植物和真菌中的內(nèi)含雜質(zhì)和多糖、多酚等都會(huì)殘留，因?yàn)檫@些雜質(zhì)分子與 RNA 有一些相似性，可與 RNA 同時(shí)沉淀或者吸附，因此在植物和真菌組織的提取中，需要用一些特別的步驟或者特別的試劑來(lái)去除多糖多酚等雜質(zhì)的干擾和污染。

RNA 評(píng)價(jià)與鑒定

提取得到 RNA 溶液后，我們需要對(duì) RNA 進(jìn)行相關(guān)的質(zhì)量檢測(cè)，以確定它是否符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。RNA 用于不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)其質(zhì)量要求不盡相同。cDNA 文庫(kù)構(gòu)建要求 RNA 完整且無(wú)酶等抑制物殘留；Northern blot 實(shí)驗(yàn)對(duì) RNA 完整性要求較高，對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RT-PCR 實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA 完整性要求不太高，但對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。因此在進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)選擇不同的方法純化RNA，以達(dá)到j(luò)ia的實(shí)驗(yàn)效果。

RNA 得率檢測(cè)—分光光度計(jì)法

RNA 得率有很強(qiáng)的組織特異性，不同組織 RNA 的豐度和 RNA 提取的易難程度共同決定了該種組織的 RNA 得率。一般來(lái)說(shuō)，可通過分光光度計(jì)測(cè)定 RNA 溶液在 260nm 處的吸光值來(lái)計(jì)算 RNA 的含量。RNA 溶液在 260、320、230、280nm下的吸光度分別代表了核酸、溶液渾濁度、雜質(zhì)濃度和蛋白等有機(jī)物的吸收值。用標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得在波長(zhǎng)260nm 處，1ug/mlRNA 鈉吸光度0.025（光程為1cm），即OD260=1時(shí)，樣品中 RNA 濃度為 40ug/ml。通常分光光度計(jì) OD260 的讀數(shù)要介于 0.15-1.0 之間才是可靠的。因此 RNA 提取結(jié)束后，要根據(jù)大概產(chǎn)量稀釋到適當(dāng)濃度范圍，再用分光光度計(jì)檢測(cè)。

按下面的共識(shí)計(jì)算總 RNA 濃度：

• RNA 濃度（ug/ml）=OD260×稀釋倍數(shù)×40ug/ml

RNA 純度檢測(cè)---分光光度計(jì)法

通過 OD260/280 來(lái)檢測(cè) RNA 純度，OD260/230 作為參考值。

OD260/280 在 1.9-2.1 之間，可以認(rèn)為 RNA 的純度較好；

OD260/280 值小于 1.8，則表明蛋白雜質(zhì)較多；

OD260/280 值大于 2.2，則表明 RNA 已經(jīng)降解；

OD260/230 值小于 2.0，則表明裂解液中有異硫氰酸胍和β-巰基乙醇法殘留。

注意：如果用 TE 溶解或洗脫 RNA，會(huì)使 OD260/280 值偏大。