Western Blot實(shí)驗(yàn)內(nèi)參的重要性-上海信帆生提供Western Blot實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)，檢測(cè)周期快，結(jié)果真實(shí)可靠！

Western Blot 即免疫印跡試驗(yàn)，可以利用 Western Blot 來比較在不同條件下，不同細(xì)胞組織中目的蛋白表達(dá)量的差異，屬于定性，半定量試驗(yàn)。既然有差異性比較，參照物*。Western Blot 試驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)（表達(dá)量）參照物即內(nèi)參，有了參照物才能準(zhǔn)確地比較目的蛋白表達(dá)量的差異。內(nèi)參一般選用管家基因表達(dá)的蛋白，它們?cè)诟鱾€(gè)組織細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)恒定，不會(huì)因?yàn)橥獠織l件變化而引起表達(dá)量的變化。而且內(nèi)參可以監(jiān)測(cè)整個(gè)試驗(yàn)體系是否正常，比如蛋白提取過程，轉(zhuǎn)膜體系，顯色體系等。

       beta Actin、beta Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 等已作為成熟的內(nèi)參運(yùn)用到試驗(yàn)中，下面就大致介紹下如何選擇內(nèi)參：

       樣本來源

       ● 如果是哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞，主要以 beta Actin、beta Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 為代表；

       ● 如果是植物樣本，主要以 actin、Rubisco 為代表。

       目的蛋白定位

       ● 全細(xì)胞蛋白和細(xì)胞質(zhì)：beta Actin、beta Tubulin、GAPDH 等；

       ● 細(xì)胞核蛋白: PCNA 等；

       ● 核膜蛋白：Lamin B1 等；

       ● 胞膜蛋白：Na(+)/K(+) ATPase 等。

       目的蛋白分子量

       beta Actin、beta Tubulin、GAPDH 的分子量分別是 42kd，50kd，37kd，目的蛋白分子量好能與內(nèi)參蛋白分子量相差 5kd 以上，才能分開目的蛋白和內(nèi)參，寫文章做圖也更美觀；

三大內(nèi)參

       beta Actin，肌動(dòng)蛋白，細(xì)胞骨架蛋白。它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來做參照物。beta Actin 作為內(nèi)參是得到*的，針對(duì)大多數(shù)組織和細(xì)胞來說的，它廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，表達(dá)量非常豐富。但是在一些少量特殊的情況下比如脂肪組織和細(xì)胞內(nèi)，beta Actin 的表達(dá)量就很少。

       GAPDH，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，該酶是糖酵解反應(yīng)中的一個(gè)酶，幾乎在所有組織細(xì)胞中都高水平表達(dá)，在同種細(xì)胞或組織中的表達(dá)量一般是恒定的，且很少受外部誘導(dǎo)物的影響。但比如缺氧和糖尿病等疾病存在下，會(huì)增加 GAPDH 在特定細(xì)胞和組織中的表達(dá)。

       beta Tubulin，微管蛋白，細(xì)胞骨架蛋白。作為內(nèi)參抗體，beta Tubulin 表達(dá)通常不會(huì)發(fā)生改變，因此被廣泛用于 Western Blot 內(nèi)參，也常被用于免疫染色觀察細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)。

       下面是信帆生物多年實(shí)驗(yàn)的一點(diǎn)心得，希望對(duì)大家有幫助。

       1. 不同的內(nèi)參在選擇上也要根據(jù)具體的樣本情況選擇，沒有一種內(nèi)參能適用所有的組織和細(xì)胞樣本。比如，血紅細(xì)胞（因?yàn)槠浼?xì)胞結(jié)構(gòu)的特殊性和需要攜帶氧氣的功能性）樣本就不適合以上 3 種常用內(nèi)參。如果使用會(huì)導(dǎo)致結(jié)果很差或者沒有結(jié)果。可以選用血紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)性蛋白作為內(nèi)參代替。

       2. 在做多組織多細(xì)胞樣本對(duì)比表達(dá)量時(shí)，好選用 GAPDH 作為內(nèi)參，因?yàn)?GAPDH 是代謝類蛋白，在活組織中表達(dá)比較恒定。而 beta Actin 和 beta Tubulin 是結(jié)構(gòu)蛋白，不同組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)會(huì)有差異性，如腦組織的 tubulin 的表達(dá)會(huì)高一些（因?yàn)樯窠?jīng)細(xì)胞的軸突和樹突都由 tubulin 維持結(jié)構(gòu)），而 actin 的表達(dá)量可能會(huì)低一些。再比如，骨骼肌、心肌和平滑肌的特殊功能反而導(dǎo)致了 tubulin 的表達(dá)改變和特化。心肌的 beta Actin 的表達(dá)量可能變少，而 alpha Actin 表達(dá)量高。因?yàn)檫@些組織的差異，現(xiàn)在慢慢采用總 Actin 和總 tubulin 作為內(nèi)參，可以盡量減少一些組織表達(dá)量差異。

       3. 做各種分泌液樣本的時(shí)候，如血漿，乳汁，組織液等，以上的 3 種內(nèi)參也不是很合適。由于沒有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，所以只能選擇一些分泌蛋白作為內(nèi)參，或者采用其他方式作為內(nèi)參。

       4. 做誘導(dǎo)后樣本或檢測(cè)磷酸化等修飾性抗體時(shí)，選擇結(jié)構(gòu)蛋白作為內(nèi)參，如 beta Actin 和 beta Tubulin。因?yàn)?GAPDH 是代謝類蛋白，表達(dá)量有可能會(huì)受到誘導(dǎo)處理的影響。同時(shí)，做修飾性抗體的 Western Blot 實(shí)驗(yàn)，好也帶上同抗原的總抗作為陽性對(duì)照。

       5. 做 Western Blot 實(shí)驗(yàn)時(shí)，內(nèi)參的條帶強(qiáng)度也要適當(dāng)控制。不要讓內(nèi)參條帶發(fā)生過度曝光的情況，尤其是用 X 膠片曝光的。如果內(nèi)參條帶過度曝光，條帶會(huì)顯得很寬，妨礙對(duì)條帶正確強(qiáng)度的判讀，進(jìn)而影響對(duì)其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。好的內(nèi)參結(jié)果是： 窄窄的，黑色實(shí)心條帶。

Western Blot實(shí)驗(yàn)內(nèi)參的重要性